近日，医院张会来教授和王先火教授团队在肿瘤免疫治疗领域权威期刊JournalforImmunoTherapyofCancer（IF=13.）发表了题目为“GeneticcharacteristicsinvolvingthePD-1/PD-L1/L2andCD73/A2aRaxesandtheimmunosuppressivemicroenvironmentinDLBCL”的研究成果，该研究基于全外显子测序、靶向深度测序、荧光原位杂交技术、RNA-Seq、单细胞转录组测序和多色免疫荧光等技术，全面揭示了DLBCL中PD-1/PD-L1/L2和CD73/A2aR新型遗传机制，提出了由PD-1/PD-L1/L2和CD73/A2aR轴共同介导的免疫耗竭性微环境，并基于CD8+T细胞耗竭程度，提出了不同分级的免疫耗竭微环境。其中，单细胞转录组测序分析部分由新格元科服和生信团队支持，单细胞技术助力发现CD8+T细胞上PD-1和A2aR表达与耗竭CD8+T细胞数显著正相关。
研究背景
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的B细胞淋巴瘤。大约60%-70%的患者经R-CHOP治愈，其余30%-40%的患者由于高度的侵袭性和异质性，最终出现复发和难治，因此有必要进一步了解DLBCL的发病机制，并探索新的治疗策略。
靶向PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂在多种实体瘤、霍奇金淋巴瘤（HL）、原发纵隔大B细胞淋巴瘤等恶性肿瘤中有效，但是仅有一小部分的DLBCL患者能从中获益。由于免疫检查点单一疗法很难长期有效，因此PD-1/PD-L1抑制剂与其他免疫检查点抑制剂联合使用已经成为未来的治疗策略之一。
CD73/A2aR介导的腺苷信号传导是重要的免疫抑制途径。CD73在恶性细胞中广泛表达并促进腺苷的产生，是该过程的限速酶。肿瘤微环境（TME）中腺苷水平升高会激活A2aR并抑制细胞*性T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞的免疫反应。靶向CD73/A2aR可恢复CD8+T细胞杀伤活性并增强抗PD-1和抗CTLA4抗体的抗肿瘤活性。然而，目前对CD73/A2aR的遗传特征和介导的免疫抑制途径的机制仍不清楚。
研究结果
一、SP与PD-L1发生基因融合
研究者通过对DLBCL肿瘤组织及匹配外周血DNA进行全外显子测序，发现DLBCL肿瘤组织中存在频繁的免疫相关基因遗传改变，包括PD-1/PD-L1/L2、CD73和A2aR；拷贝数变异分析显示，7%的患者存在9p24.1扩增，但是CD73和A2aR基因扩增并未观察到。在样本DL中发现了PD-L1和SP发生了基因融合，Sanger测序验证了靶向测序的结果，基因组断点发生在Chr9:和Chr2：（位于PD-L1的3’UTR区域和SP下游的基因间区）。FISH实验显示与PD-1基因座的分离，qPCR实验和免疫组化（IHC）实验表明，样本DL中PD-L1和SP基因组融合，PD-L1表达显著上调。
图1PD-L1-SP基因融合
二、PD-L1-PD-L2发生基因倒位
在样本DL中首次检测到由PD-L1内含子5与PD-L2内含子3融合引起框内PD-L1-PD-L2倒位，Sanger测序验证了靶向测序的结果。qPCR和IHC实验证明携带PD-L1-PD-L2倒位的样本DL中PD-L1表达量增加，而PD-L2表达量降低。与此同时，研究者也揭示了PD-L1/L2的基因突变特征，并发现了系列未曾报道过的突变位点，但这些突变不会引起PD-L1表达上调。
图2PD-L1-PD-L2基因倒位
三、CD73突变提高DLBCL总生存期
在携带2个错义突变的4个病例中发现了CD73的基因突变，c.CT，使得编码高度保守的丙氨酸被缬氨酸取代，该突变为首次报道的新型突变。另一个突变，c.TC，在位色氨酸取代了甲硫氨酸。qPCR和IHC实验证明，突变使CD73mRNA表达降低。生存曲线分析表明CD73基因突变或缺失的患者比CD73正常的患者预后更好，提示CD73突变可能是一种功能缺失型突变，一旦发生突变可削弱CD73介导的免疫抑制效应。
图3CD73突变提高DLBCL总生存期
四、PD-1/PD-L1和CD73/A2aR通路介导TME免疫抑制
基于bulkRNA测序，将患者根据PD-L1的表达分为高表达组和低表达组，GSEA富集分析结果表示与免疫负调节的通路如：T细胞介导免疫负调节和细胞因子产生负调节的通路显著富集在PD-L1高表达组中。将患者根据CD73的表达分为高表达组和低表达组，GSEA富集分析结果表示与免疫系统过程负调控相关的通路，主要富集在CD73高表达组中。综上所述，PD-1/PD-L1和CD73/A2aR都积极参与了免疫反应的负调节，导致DLBCL中的TME呈现免疫抑制性。
图4DLBCL中PD-1/PD-L1和CD73/A2aR通路介导的TME的免疫抑制
五、单细胞测序分析PD-1和A2aR在功能失调的CD8+T细胞中的作用
使用公共数据集GSE其中4例样本（DLBCL、DLBCL、DLBCL、DLBCL）进行分析，将CD8+T细胞分为7个亚群，其中群1注释为功能失调型的CD8+T细胞。发现DLBCL在功能失调型的CD8+T细胞不表达PD-1和A2aR，DLBCL和DLBCL仅表达PD-1，DLBCL同时表达PD-1和A2aR，其含有大量的功能失调的CD8+T细胞。为了更直观地观察PD-1和A2aR的表达与CD8+T细胞之间的关系，将4例样本CD8+T细胞的细胞数调整到相同水平，发现PD-1或A2aR的表达与功能失调型的CD8+T细胞数量呈正相关（R2=0.，P=0.）。
图5单细胞测序分析PD-1和A2aR在功能失调的CD8+T细胞中的作用
六、功能失调的CD8+T细胞与DLBCL患者的临床反应的相关性
研究者基于CD8+T细胞耗竭程度，提出了不同分级的免疫耗竭微环境。耗竭CD8+T细胞（PD-1+或A2aR+）显著降低患者的无进展生存和总生存。根据PD-1和A2aR表达，不同耗竭程度CD8+T细胞可以区分患者预后，其中2级耗竭CD8+T细胞预后最差、0级耗竭CD8+T细胞预后最好。
无响应患者CD8+T细胞数量显著高于有响应患者。PD-1+CD8+T细胞患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）要显著短于PD-1-CD8+T细胞患者（p=0.,p=0.01）。同样，A2aR+CD8+T细胞患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）也比正常CD8+T细胞（A2aR-CD8+T细胞）患者更低（p=0.，p=0.）。
图6功能失调CD8+T细胞在DLBCL中的表达
图7功能失调的CD8+T细胞与DLBCL患者的临床存活期相关性
结论
（1）在DLBCL患者中发现SP与PD-L1发生基因融合以及PD-L1与PD-L2倒位；
（2）CD73突变患者DLBCL总生存期更长；
（3）bulkRNA测序表明PD-1/PD-L1和CD73/A2aR都积极参与了免疫反应的负调节，导致DLBCL中的TME呈现免疫抑制性；
（4）单细胞测序表明PD-1或A2aR的表达与功能失调型的CD8+T细胞数量呈正相关；
（5）无响应患者CD8+T细胞数量显著高于有响应患者；
（6）耗竭CD8+T细胞（PD-1+或A2aR+）显著降低患者的无进展生存和总生存。
（7）不同耗竭程度CD8+T细胞可以区分患者预后，其中2级耗竭CD8+T细胞预后最差、0级耗竭CD8+T细胞预后最好。
参考文献
ZhangT,LiuH,JiaoL,etal.GeneticcharacteristicsinvolvingthePD-1/PD-L1/L2andCD73/A2aRaxesandtheimmunosuppressivemicroenvironmentinDLBCL.JournalforImmunoTherapyofCancer;10:e.doi:10./jitc--
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