原发纵隔大B细胞淋巴瘤（PMBCL）作为一种侵袭性淋巴瘤，通常好发于青壮年，女性多见，表现为纵隔大肿块。PMBCL起源于胸腺髓质B细胞，属于弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的特殊亚型，具有独特的生物学特性、免疫组化表型、病理形态及临床特征。以蒽环类为基础的化疗方案是PMBCL最常用的治疗方案，放疗、自体造血干细胞移植也可使部分患者受益。尽管PMBCL是一种高度可治愈性疾病，但复发/难治PMBCL尚缺乏有效的治疗手段。年，美国FDA快速批准Pembrolizumab用于复发/难治性PMBCL治疗，但是该疾病对免疫治疗敏感的遗传机制尚不完全清楚。因此，美国波士顿达纳法伯癌症研究所学者对新诊断的PMBCL患者和cHL患者的遗传学特征进行了全面基因组分析。这将为阐明这两种疾病的发病机制以及对PD-1单抗治疗产生反应和耐药机制提供新的见解。相关研究结果发表在Blood杂志上（ChapuyB,etal.Blood.;(26):-.）。
主要亮点1）基因组分析结果显示：PMBCL具有多种驱动基因突变，这包括涉及JAK/STAT和NF-κB信号通路已知和新发现的元件基因突变、限制MHCⅠ类分子表达的常见B2M改变以及新发现的ZNF基因突变；
2）PMBCL具有高突变负荷、微卫星不稳定（MSI）和APOBEC特征可能是PD-1单抗治疗敏感的另外一些机制。
PMBCL中显著的驱动基因突变研究者对37例PMBCL患者（中位年龄34岁，女性70%）诊断活检标本和3种其他PMBCL细胞系进行分析，从中发现了15种候选癌基因（CCGs）（q0.1）。这些CCGs包括在PMBCL中具有已知功能的一些基因，比如IL4R、TNFAIP3、其他B细胞淋巴瘤突变驱动基因（B2M、GNA13、EZH2、STAT6、IKZF3、XPO1、TP53、PAX5）和其他肿瘤突变驱动基因（TP53和XPO1）（见下图A）。值得注意的是，3D蛋白结构显示：突变集中在STAT6和ZNF的DNA结合域以及ZNF与其他蛋白的相互作用功能域，这意味着这些特定的基因改变具有特定的功能（见下图B和C）。
具体来讲，STAT6突变（43%患者）、IL4R突变（30%患者）和CSF2RB突变（14%患者）是涉及JAK/STAT信号通路的CCGs（见下图A-C）。STAT6DNA结合域中的突变包括之前在滤泡淋巴瘤中认为是功能获得型改变的p.D热点（见下图D）。更为重要的是，研究者证实了在PMBCL中新近发现的IL4R功能获得型突变（包括在IN的热点）。CSF2RB中的突变值得注意是因为这些受体参与JAK/STAT信号通路，CSF2RB编码GM-CSF、IL-3和IL-5的共同β-亚基。研究者还鉴别出之前在IRF2BP2中未报道的频发突变（19%），IRF2BP2编码与IRF2相互作用的转录辅助因子，该因子能在某些肿瘤模型中调控IFN-γ诱导的PD-L1表达（见下图A-C）。
除了证实NF-κB负调控因子TNFAIP3的常见突变（41%），研究者还分别鉴别了PAX5（11%）和IKZF3（11%）的频发突变，PAX5和IKZF3分别编码B细胞转录因子PAX5和Ailos（见下图A和C）。PMBCL的TP53的频发突变频率（22%）与DLBCL的相似。有趣的是，研究者还发现了XPO1中的热点EK突变（16%），XPO1编码一种输入蛋白β的家族成员，该成员将某些蛋白和RNAs运输到细胞质，这些蛋白包括p53和STAT6。这些XPO1热点突变集中在货物蛋白识别槽中，并如之前在PMBCL中发现的那样能增加XPO1活性。
PMBCL具有之前根据基因表达谱划分为生发中心B细胞DLBCL中报道的几种基因突变。这些突变包括在GNA13突变（35%）以及EZH2中热点Y突变（14%），EZH2为多梳蛋白抑制复合体2（PRC2）催化亚基（见下图A和D）。研究者还在HIST2H1E和HIST1H2BE中发现了一些突变，这些组蛋白基因也在一部分GCBDLBCL中是异常的。
研究者发现43%PMBCL具有锌指蛋白（ZNF）常见突变（见下图A-C）。ZNF与DNA结合，并招募几种能在表观遗传水平调控基因表达的多蛋白复合物。之前研究报道了20q13的频发扩增，该区域包括在多种实体瘤（乳腺癌、结肠癌和肝细胞癌）中的ZNF。在某些实体瘤肿瘤模型中，ZNF增强表达能限制细胞凋亡、促进上皮向间质转化和增加细胞增殖。但是，PMBCL中ZNF的突变模式提示处于一种失活状态。ZNF转录水平在一部分具有野生型或突变的ZNF和可获得的基因表达谱的PMBCL是相似的。
在PMBCL中最常见显著突变基因为B2M，该基因编码β-微球蛋白（β2M），这是MHCⅠ类分子的轻链。β2M负责将胞内MHCⅠ类分子正确运输到细胞质膜上，并对内源性降解的“自我-”和“非自我-”抗原递呈是必需的。β2M在cHL中也经常发生突变，但在一项PMBCL的靶标分析中发现突变不常见。值得注意的是，研究者发现之前报道的JAK/STAT和NF-κB信号通路修饰物存在其他突变，前者包括SOCS1（35%[13/37]at32sites）和PTPN1（14%[5/37]at6sites），后者包括NFKBIE（19%[7/37]at11sites）。
PMBCL的突变特征分析为了研究PMBCL的突变特征，研究者采用SignatureAnalyzer工具进行分析。有趣的是，研究者发现：3/37（8%）患者具有与DNA错配修复缺陷和微卫星不稳定相关的MSI特征。与预期一致的是，这3例患者样本具有高突变表型，短的插入缺失突变数量显著增加（p=0.）（见上图A，下图2A和B）。这些错配修复缺失分子基础包括2例存在MLH1移码突变和2例PMS2存在的双等位基因、可能失活的突变（1例同时具有MLH1和PMS2突变）。研究观察到PMBCL和cHL的MSI相关高突变发生率相当，且都显著高于DLBCL中的MSI发生率（0.3%）。这些研究结果值得注意，原因在于MSI已经在某些实体瘤中认为与增加PD-1单抗治疗敏感性相关。
本项研究中的PMBCL队列患者年龄较年轻，研究发现：其他突变大部分是因为CpGs中胞嘧啶自动脱氨导致的。这种突变特征常与诊断时患者年龄较大相关（见下图A和B）。这种突变较高频率是由于青壮年出现的“老化”特征（4.5个突变/Mb），这是PMBCL和cHL另外一个共同的遗传特征。与cHL一样，PMBCL中另一个最普遍的突变特征是APOBEC和AID（见下图A和B）。研究发现：19%PMBCL存在APOBEC特征，这值得注意是因为在非小细胞肺癌这APOBEC特征与PD-1单抗疗效增加相关。为了发现诱发APOBEC突变增加的分子机制，研究者对具有高APOBEC特征（SNPrs）的PMBCL病例进行基因分型，研究发现：37例PMBCL中有8例患者具有rs位点多态性，包括3例具有最高APOBEC特征患者中的2例。事实上，具有rs位点多态性患者具有显著更高的APOBEC活性。
研究者还对“老化”、APOBEC和AID特征对PMBCL驱动基因突变的相对贡献进行评估，结果发现：TP53和HIST2H2BE突变完全是由于CpGs自发脱氨导致的（“老化”），XPO1和CSFR2B突变主要是由于“老化”突变模式导致的，这与cHL中的一样。相反，STAT6受这3种突变机制（老化、APOBEC和AID）共同影响（见下图C）。
PMBCL中体细胞拷贝数改变（SCNAs）和结构变异（SVs）研究发现17种频发的SCNAs，包括10种拷贝增加（2focaland8armlevel）和7种拷贝缺失（6focaland1armlevel）。9p/9p24.1/PD-L1/PD-L2和2p/2p16.1/REL的拷贝数增加在PMBCL中发生比例分别为70%（26/37）和36%（11/37）。这和之前在PMBCL中所报道的PD-1配体和REL表达增加是一致的。常见的focal拷贝缺失包括6q21.32/MHCⅠ/Ⅱ（32%）、6q23.3/TNFAIP3（16%）和15q15.1/B2M（21%）（见下图A）。
SVs检测结果发现：4/37（11%）患者出现CⅡTASVs，这与之前的研究相一致；PD-1配体的SVs不常见（2/37），这些不常见的SVs包括PD-1两种配体的串联重复、PD-L13’UTR缺失（见下图B和C）。PD-L13’UTR缺失已经认为是T-NHL和DLBCL中PD-L1异常表达的另外一种机制。此外，研究者发现两种功能性获得型的易位，会导致Ig超增强子与BCL2或WBP2并列（见下图C）。WBP2最近发现是一种癌基因，它在乳腺癌Hippo和Wnt信号通路中发挥转录共同激活剂作用。
基因改变与受影响信号通路的共现关系在发现PMBCL中频发驱动基因之后，研究者对单个肿瘤和所有患者的基因改变模式进行了研究。发现以下研究结果：
影响驱动基因的多种机制
频发的CCGs、SCNAs和SVs的联合分析显示：多种机制影响了某些候选驱动基因。这些基因包括：1）TNFAIP3改变（总体59%，突变41%，focal拷贝数缺失24%，双等位基因6%）增加NF-κB信号通路；以及2）B2M改变（总体51%，突变30%，focal拷贝数缺失27%，双等位基因6%）限制MHCⅠ类抗原递呈（见下图A）。
影响信号通路和免疫识别的多种机制
3种类型基因改变的联合分析结果还揭示影响特定信号通路的多种机制。尤其是，81%（30/37）肿瘤出现一个或多个影响JAK/STAT通路元件的基因改变，其中包括：IL4R突变（32%）、9p/9P24.1/JAK2拷贝数增加（70%）、STAT6突变（43%）、CSFR2B突变（14%）、SOCS1SVs（3%）和IRF2BP2突变（19%）。57%（21/37）PMBCL患者出现影响染色质的CCGs，包括ZNF、EZH2、HIST1H1E和HIST2H2BE突变（见下图A）。
81%（30/37）PMBCL患者肿瘤中存在PD-1介导肿瘤免疫逃逸的潜在遗传基础。而且，这些PMBCL患者中还有73%（22/30）患者存在抗原递呈通路元件的基因改变，这些基因改变包括：B2M拷贝数缺失或突变、6q21.33拷贝数缺失（MHCⅠ/Ⅱ位于其中）、EZH2突变和CTⅡA的SVs（见下图A）。
总的来说，研究者在PMBCL中发现了一系列影响NF-κB、JAK/STAT信号通路以及免疫识别和表观调控的基因改变。
其他遗传子结构（geneticsubstructure）
虽然绝大多数PMBCL存在9p拷贝增加和频发的6p21.33拷贝缺失，但是层次聚类显示其他遗传子结构。树状图的左分支中PMBCL包括了3种已经发现的高频突变基因以及具有显著更高频率CCGs的其他肿瘤（p=0.），这些CCGs为ZNF（p=0.）和TNFAIP3（p=0.）（见下图A）。左分支中的患者明显更可能是女性（81%女性，左边vs45%男性，右边，p=0.05）以及明显更可能诊断时更年轻（33.5岁，左边vs38岁，右边），这强调遗传子结构的潜在临床相关性（见下图A）。
克隆和亚克隆基因改变
研究者评估了每种基因改变的肿瘤细胞比例，比如携带每种基因改变的肿瘤细胞比例。有趣的是，PMBCL中大部分频发的基因改变是克隆性的（见下图B）。因为PMBCL好发于女性一样，研究者特定寻找那些在X染色体上富集的基因改变，并进行了X染色体特异性拷贝数评估。但是，这些分析没有发现对于PMBCL好发于女性的X染色体相关的解释。
PMBCL中抗原递呈通路的评估如前文所述，多种频发基因改变（包括B2M突变、B2M和MHCⅠ/Ⅱloci的focal拷贝数缺失、CTⅡA结构变体以及EZH2突变）会影响抗原递呈通路。最近认为EZH2突变是淋巴瘤中降低MHCⅠ类和MHCⅡ类分子表达的一种机制。因此，研究者进一步将PMBCL中β2M、MHCⅠ类和Ⅱ类蛋白表达与复合基因特征进行了比较。
研究者对28份PMBCL组织样本中β2M、MHCⅠ类和MHCⅡ类分子进行染色，并评分。结果发现：46%（13/28）、43%（12/28）和75%（21/28）肿瘤细胞分别具有可检测（阳性[H-评分：＞]或减弱的[H-评分：10-99]）的β2M、MHCⅠ类和MHCⅡ类膜蛋白表达（见下图A和B）。正如cHL中一样，研究者观察到单个PMBCL患者中β2M和MHCⅠ类之间表达的显著相关性（p＜0.），然而MHCⅠ类和MHCⅡ类表达是独立的参数（见下图A）。MHCⅠ类通路元件中基因改变与缺乏MHCⅠ类分子表达之间存在显著相关性（p=0.），但这种相关性不存在于MHCⅡ类基因改变与其细胞表面表达之间（见下图A）。3例具有EZH2突变PMBCL患者缺乏MHCⅠ类分子表达，其中有2例患者还缺乏MHCⅡ类分子表达（见下图A）。
分析的PMBCL大部分具有：1）细胞表面均表达MHCⅠ和Ⅱ类分子（见下图A和D，第一行）；2）细胞表面仅表达MHCⅡ类分子（见下图A和D，第二行）；或者3）MHCⅠ和Ⅱ类分子均缺乏表达或降低表达（见下图A和D，第三行）。有趣的是，研究者在cHL中发现存在相似表达模式（表达MHCⅡ类分子但不表达MHCⅠ类分子），该表达模式可以预测PD-1单抗治疗的疗效。
在分析完PMBCL患者中MHCⅠ类和Ⅱ类分子表达特征后，研究者采用多参数光谱成像（PAX5、CD3、CD4、CD8、CD68、DAPI）和已经建立的方法对肿瘤中免疫浸润其他组分进行了评估，结果发现：具有较高MHCⅡ类分子表达的PMBCL存在更多数量的肿瘤浸润CD3+/CD4+T细胞（p=0.08）。此外，缺乏MHCⅠ类分子表达PMBCL的肿瘤浸润CD68+巨噬细胞数量显著更多（p=0.）。考虑最新发现的MHCⅠ类分子在保护肿瘤细胞避免巨噬细胞介导的吞噬作用中的作用，CD68+巨噬细胞浸润和MHCⅠ类分子表达的负相关性可能具有功能相关性。
PMBCL与其他淋巴瘤和实体瘤相比基因改变情在发现这些PMBCL患者的频发基因改变（CCGs、CNAs、SVs）之后，研究者将这些基因改变的频率与最近文献报道的一组PMBCL、研究者自己cHL和DLBCL数据进行比较，研究者发现：在自己PMBCL样本中发现的15种CCGs中有10种和4种CNAs也存在于其他PMBCL样本中。
研究者的PMBCL样本中具有与cHL共同的几个遗传学特征，这些特征包括9p/9p24.1/PD-1配体的频发的拷贝增加，以及涉及NF-κB和JAK/STAT信号通路活化和影响抗原递呈的多种基因改变。有些差异包括：与cHL相比，PMBCL中发现的ZNF、TP53、IRF2BP2、EZH2和某些组蛋白基因（HIST2H2BE）的频发突变的频率要低。相反的是，某些改变（比如BCL2和BCL6易位）在DLBCL中更为普遍，但在PMBCL和cHL中不常见。DLBCL和PMBCL中的TP53突变频率相近，分别为21%和22%（见下图A）。然而，DLBCL中一部分患者TP53发生双等位基因改变，而PMBCL仅出现TP53单等位基因突变。
研究者还将PMBCL中所有突变、克隆突变和驱动突变频率与TCGA数据库中的进行了比较，研究发现：PMBCL的中位突变频率（7mutations/MB）显著高于DLBCL（p=8×10-6）和大部分实体瘤的，且与膀胱癌和肺腺癌的突变频率相当（见下图B）。PMBCL相对较高的突变频率可能会导致新生抗原的产生，这可能是PMBCL对PD-1单抗治疗敏感的原因之一。
小结该研究对PMBCL和cHL的免疫逃逸分子机制进行了全面分析，这将有助于研究PD-1单抗在相关淋巴瘤中产生反应和耐药的分子机制，将为后续新的联合治疗策略的开发奠定基础。
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